Techniki mikroskopowe

Zajęcia wymagają zaliczonych kursów z biologii komórki, biochemii oraz chemii.

3 ECTS

30 Godziny kontaktowe z prowadzącym zajęcia realizowane w formie zajęć dydaktycznych:

30 - laboratoria

45 Godziny niekontaktowe przeznaczone na pracę własna studenta:

10 - Przygotowanie się studenta do zajęć dydaktycznych

20 - Przygotowanie się studenta do zaliczeń

15 - Studiowanie przez studenta literatury przedmiotu

Łączna liczba godzin dydaktycznych realizowanych w ramach przedmiotu - 75

Sposób weryfikacji efektów kształcenia na studiach pierwszego stopnia zatwierdzonych na podstawie Uchwały Senatu UMCS Nr XXII-39.6/12 z dnia 25 kwietnia 2012 r. tj. od cyklu kształcenia 2016/2017:

obecność na ćwiczeniach i kolokwia śródsemestralne (W1-W5, U1-U2, K1-K3)

Sposób weryfikacji efektów kształcenia na studiach drugiego stopnia zatwierdzonych na podstawie Uchwały Senatu UMCS Nr XXIV-27.18/19 z dnia 29 maja 2019 r. tj. od cyklu kształcenia 2019/2020

obecność na ćwiczeniach i kolokwia śródsemestralne (W1-W2, U1-U4, K1-K2)

Ćwiczenie 1

a/ Budowa i zasada działania mikroskopu elektronowego: transmisyjnego i skaningowego (1,5h) b/ wizyta w pracowni mikroskopii elektronowej

Ernst Ruska – pionier mikroskopii elektronowej; Budowa i funkcjonowanie transmisyjnego

mikroskopu elektronowego (TEM): zdolność rozdzielcza, maksymalne powiększenie, napięcie przyspieszające, katoda, anoda, soczewki elektromagnetyczne, kolumna mikroskopu, ekran fluorescencyjny/detektor kamery wideo/klisza; Zasada powstawania obrazu w transmisyjnym mikroskopie elektronowym: rozpraszanie elastyczne i nieelastyczne, absorpcja elektronów. Zastosowania TEM;

Skaningowy mikroskop elektronowy: Schemat kolumny: działo elektronowe, kondensor (pierwsza soczewka ogniskująca wiązkę), (soczewka pośrednia; opcjonalnie w niektórych modelach), układ cewek odchylających (zapewnia skanowanie wiązki), obiektyw (końcowa soczewka ogniskująca wiązkę, nie jest to obiektyw obrazujący próbkę), detektor(jeden lub więcej) umieszczony nad preparatem; Zasada powstawania obrazu w mikroskopie skaningowym : elektrony wtórne, elektrony wstecznie rozproszone; napięcia przyspieszające do 30kV, rozdzielczość – 3nm; zastosowania SEM; Mikroskop elektronowy kontra optyczny: zdolność rozdzielcza, długość fali wiązki elektronowej a długość fali światła, obserwowane obiekty, skala powiększenia; Źródło światła i działo elektronowe; soczewki magnetyczne i soczewki szklane;

b/ Wizyta w pracowni mikroskopii elektronowej UMCS (1h)

Budowa i zasada działania mikroskopu elektronowego, ogólna procedura przygotowania preparatów mikroskopowych: utrwalacze, żywice, odwadnianie, zatapianie, trymowanie, ultracięcie, siatki, noże, bloczki;

Obserwacje preparatów w mikroskopie, obserwacja elektronogramów z wybranych komórek, tkanek, organów zwierzęcych, wirusów i bakterii: komórki z hodowli in vitro- HeLa, LS, glejaki, HSF; korzenie słonecznika, bobiku; liście Arabidopsis i Thlaspi; Wybrane tkanki Acomys i szczura; bakterie: Mycobacterium-prątki, Legionella; bakteriofagi, drożdże;

Ćwiczenie 2

Praktyczne wykonanie preparatów w skaningowym mikroskopie elektronowym

Krótkie przypomnienie procedury przygotowania preparatów do SEM; Naklejanie szkiełek na stoliki, napylanie, obserwacja preparatów w SEM (każdy student rejestruje swój obrazek), wydruk obrazów z mikroskopu, interpretacja obrazów przez studentów

Ćwiczenie 3

a/ Budowa i zasada działania mikroskopu konfokalnego. b/ Wizyta w pracowni mikroskopii konfokalnej

Marvin Minsky- pionier obrazowania konfokalnego; Cechy charakterystyczne mikroskopii konfokalnej: kontrast, rozdzielczość; Skanujący laserowy mikroskop konfokalny: laser- źródło światła, obiektyw, okular, przekroje optyczne preparatu, detektor, lustro dichroiczne, lustra skanujące, barwniki fluorescencyjne, przesłona, filtry, fotopowielacz;

Zastosowania mikroskopii konfokalnej; Techniki zaawansowane dedykowane dla mikroskopii konfokalnej: FRET (Fluorescence/Forster resonance energy transfer), FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching), FLIP (Fluorescence loss in photobleaching), FLIM (Fluorescence lifetime imaging microscopy).

b/ Wizyta w pracowni mikroskopii konfokalnej UMCS.

Budowa i zasada działania mikroskopu konfokalnego, procedura przygotowania preparatów mikroskopowych;

Obserwacje preparatów i zapis obrazów w mikroskopie, obserwacja prepartów: kolonii bakterii, strzępki grzyba Fusarium, kora mózgowa szczura – skan laserowy, 2 kanały, embrion muszki owocowej, embrion ryby (Danio pręgowany), pyłek roślinny (Sida), drożdże, pancerzyk owada – skan laserowy wielopłaszczyznowy, konwertowanie do obrazu trójwymiarowego, neuron, cytoszkielet, tkanka chrzęstna, zakrzep, płuco, chromosomy w jądrze fibroblastów – fazy podziału, komórki He-La, komórki heterokariotyczne, technika mozaiki – składanie zdjęć dużych obiektów, przykład – zarodek myszy;

Ćwiczenie 4

a/ Kolokwium I– Mikroskopia elektronowa: transmisyjna, skaningowa, zdjęcia z mikroskopów b/ Budowa i zasada działania mikroskopu świetlnego (jasne pole, ciemne pole widzenia, kontrast faza oraz fluorescencja)

Twórcy mikroskopów optycznych-Zachariasz Jansen - 1590; Robert Hook i jego obserwacje korka; Budowa mikroskopu świetlnego: okular, tubus, rewolwer, stolik, obiektyw, kondensor, przesłony, zwierciadło oświetlające lub sztuczne oświetlenie w postaci lamp halogenowych lub LEDów, sruba makro- i mikrometryczna; zasada działania mikroskopu świetlnego; Mikroskop ciemnego pola: zjawisko dyfrakcji promieni świetlnych, kondensor do ciemnego pola, zasada powstawania obrazu w ciemnym polu; Mikroskop kontrastowo-fazowy: parametry fali świetlnej- długość fali amplituda, faza; kondensor; zasada powstawania obrazu w mikroskopie kontrastowo-fazowym; Mikroskopia fluorescencyjna: żródło światła – lampa ksenonowa),

filtr wzbudzeni, lusterko dichroiczne, filtr barierowy (supresyjny): zjawisko fluorescencji: fotoluminescencja, naturalna fluorescencja, prawem Stokesa; zjawisko autofluorescencji i przykłady substancji zdolnych do autofluorescencji; fosforescencja, fluorochromy: właściwości, przykłady;

Ćwiczenie 5

a/ Przygotowanie preparatów do mikroskopii elektronowej b/ trymowanie bloczków w praktyce i przygotowanie siatek do mikroskopii elektronowej

Przygotowanie materiału biologicznego do obserwacji przy użyciu mikroskopu elektronowego: Pobranie materiału, Utrwalanie, Dehydratacja, Przesycanie żywicą, Zatopienie w żywicy, Krojenie ultracienkich skrawków, Kontrastowanie. Fizyczne i chemiczne utrwalanie. Nośniki utrwalaczy i kryteria ich doboru. Przykłady nośników. Rodzaje utrwalaczy i ich charakterystyka: aldehyd glutarowy, formaldehyd, akroleina, utrwalacz nadmanganianowy, czterotlenek osmu. Związki stosowane do odwadniania. Procedura przesycania. Polimeryzacja pod wpływem ciepła oraz promieniowania UV. Rodzaje żywic: żywice epoksydowe (EPON 812, Spur) oraz akrylowe (LR Gold, LR White). Etapy trymowania ręcznego. Trymowanie na ultramikrotomie. Ultramikrotomia-noże szklane i diamentowe, barwy interferencyjne skrawków, prostowanie skrawków, wyłapywanie skrawków. Trudności skrawania. Siatki stosowane w mikroskopii elektronowej.

b/ Trymowanie i przygotowanie siatek do mikroskopii elektronowej

Etapy trymowania mechanicznego bloczków zatopionych w żywicy LR White. Trymowanie ręczne i na ultramikrotomie. Umocowanie bloczków w holderze ultramikrotomu. Wygładzanie powierzchni bloczka na ultramikrotomie. Czyszczenie siatek z zastosowaniem chloroformu, etanolu i wody bidestylowanej.

Ćwiczenie 6

a/ Ultracięcie materiału biologicznego na siatki miedziane. Kontrastowanie pozytywowe siatek

a/Ultracięcie materiału biologicznego na srebrne skrawki. Prostowanie skrawków chloroformem. Wyłapywanie skrawków na siatki miedziane.

b/ Kontrastowanie pozytywowe siatek

Kontrastowanie pozytywowe- czynniki istotne w kontrastowaniu. Związki kontrastujące: czterotlenku osmu, octan uranylu, sole ołowiu, kwas fosforowolframowy, nadmanganian potasu. Kontrastowanie negatywowe. Związki stosowane w kontrastowaniu- octan uranylu, odczynnik Reynoldsa- azotan ołowiu, cytrynian sodu. Grupy funkcyjne i związki reagujące z uranem i ołowiem- PO4, kwasy asparaginowy i glutaminowy, grupy karboksylowe, grupy OH, SH. Szczegółowa procedura kontrastowania. Kontrastowanie siatek w praktyce z zastosowaniem octanu uranylu i odczynnika Reynoldsa.

Ćwiczenie 7

a/ Obserwacja i rejestracja siatek przygotowanych przez studentów w transmisyjnym mikroskopie elektronowym. b/ Wydruk zdjęć i interpretacja obrazów. Liczenie powiększenia ze znacznika skali na zdjęciach.

Ćwiczenie 8

a/ Obserwacja preparatów z zastosowaniem mikroskopii świetlnej b/ krojenie materiału biologicznego na preparaty półcienkie, obserwacja preparatów w mikroskopie świetlnym i rejestracja w mikroskopie konfokalnym

Barwienie komórek nabłonka jamy ustnej człowieka błękitem metylenowym. Komórki HeLa z hodowli in vitro – preparaty półcienkie barwione błękitem toluidyny. Komórki kory móżdżku, tkanka chrzęstna szklista z tchawicy człowieka, komórki nabłonka wielowarstwowego płaskiego z przełyku, nabłonek przejściowy moczowodu, kanalik kręty nasienny z komórkami, nabłonek wielorzędowy migawkowy z tchawicy. b/ Krojenie komórek z preparatów z hodowli in vitro na preparaty półcienkie (300-500 nm) i barwienie błękitem metylenowym. Obserwacja preparatów w mikroskopie. Rejestracja obrazów.

Ćwiczenie 9

a/ Obserwacja preparatów za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. b/ liczenie komórek apoptotycznych, prawidłowych i nekrotycznych z hodowli in vitro ( z trzech powtórzeń), test DHR

Teoretyczne wprowadzenie do zagadnień związanych ze śmiercią komórkowa- rodzaje śmierci komórkowej, porównanie apoptozy i nekrozy, cechy komórki autofagalnej, nekrotycznej i apoptotycznej; Identyfikacja komórek autofagalnych- barwienie oranżem akrydyny, identyfikacja komórek nekrotycznych i apoptotycznych- barwienie jodkiem propidionowym i Hoechst 33342; test DHR – liczenie komórek w szoku oksydacyjnym

Ćwiczenie 10

a/ Kolokwium II- Budowa i zasada działania mikroskopu świetlnego (jasne pole, ciemne pole widzenia, kontrast faza oraz fluorescencja; Przygotowanie preparatów do mikroskopii elektronowej - wszystkie etapy procedury.

b/ przygotowanie bloczka parafinowego

Przygotowanie bloczka parafinowego z przesyconych parafiną preparatów: umieszczanie preparatów do metalowych form, zalewanie płynną parafina, studzenie (temp. pokojowa i +4 oC), ściągniecie ramek (po 15 min), trymowanie bloczka parafinowego, umieszczenie w holderze mikrotomu, krojenie

Ćwiczenie 11

a/ Opis techniki histologicznej b/ barwienie preparatów histologicznych hematoksyliną i eozyną, obserwacje w mikroskopie świetlnym

a/ Etapy przygotowania preparatu histologicznego; pobranie materiału; utrwalanie i utrwalacze: proste (formalina, alkohol etylowy, aceton) i złożone; sposoby utrwalania, płukanie, odwadnianie, przepajanie, prześwietlanie, zatapianie w parafinie, krojenie skrawków parafinowych, budowa i zasada działania mikrotomu, rodzaje mikrotomów, barwienie – barwniki kwaśne i zasadowe, przykłady; zamykanie preparatu.

b/ odparafinowanie skrawków za pomocą ksylenu, uwadnianie, barwienie, odwadnianie, zamykanie preparatów, suszenie preparatów w temp. 37 stopni.

Ćwiczenie 12

a/ Kolokwium III- Mikroskopia konfokalna; Technika histologiczna b/ test rysy

Wprowadzenie teoretyczne, wykonanie rysy, barwienie szkiełek z hodowli kontrolnej i badanej metodą May-Grünwalda-Giemsy, rejestracja obrazów w mikroskopie konfokalnym (3 szkiełka na wariant), mierzenie szerokość rysy Image J, interpretacja wyników

Ćwiczenie 13

Mikroskop odwróconego pola. Hodowle komórkowe - wprowadzenie teoretyczne b/ liczenie gęstości komórek w komorze Thoma

a) Budowa i zasada działania mikroskopu odwróconego pola; wyposażenie laboratorium do hodowli komórek zwierzęcych; hodowle komórkowe - typy hodowli komórkowych (hodowle pierwotne, wtórne, ustalone linie komórkowe), środowisko hodowlane, skład pożywek hodowlanych, naczynia hodowlane, warunki prowadzenia hodowli komórkowej, pasaż komórek.

b) przygotowanie komory Thoma, odklejenie komórek z użyciem trypsyny, zawieszenie komórek w płynie hodowlanym, liczenie komórek na siatkach komory Thoma, reguła dwóch boków Bürkera, obliczenie gęstości zawiesiny komórek

Ćwiczenie 14

Kontrast neagatywowy i obserwacja preparatów w mikroskopie TEM (bakterie)

Hodowla bakterii w zawiesinie, kontrastowanie molibdenianem amonu, suszenie, obserwacja w mikroskopie, rejestracja i interpretacja obrazów.

Ćwiczenie 15

Zaliczenie ćwiczeń

1. J. Litwin, M. Gajda, WUJ 2011, Podstawy Technik Mikroskopowych

2. B. Wróbel, K. Zienkiewicz, D. Smoliński, J. Niedojadało, M. Świdziński, WUMK 2005, Podstawy Mikroskopii Elektronowej.

3. Reid N. Ultramicrotomy [in:] Glanert AM. Practical methods in electron microscopy. Vol. 3,1975.

4.Alberts B, BrayD, Johnson A, lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Podstawy biologii komórki. PWN 2005.

Na podstawie uchwały Nr XXII-39.6/12 Senatu Uniwersytetu Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie z dnia 25 kwietnia 2012 r. dla cyklu kształcenia rozpoczętego w 2016/2017, 2017/18, 2018/2019

W wyniku zrealizowanych zajęć student:

WIEDZA:

W1. Student wyciąga wnioski z obserwacji mikroskopowych i interpretuje obrazy widoczne na preparatach tj. rozpoznaje autofagię, apoptozę, prawidłowa i zmienioną strukture komórek parwidłowych i nowotworowych - K_W05

W2. Student zna zasady planowania i obserwacji preparatów biologicznych z zastosowaniem mikroskopii świetlnej, fluorescencyjnej i elektronowej- K_W06

W3. Student ma pogłębioną wiedzę z fizyki i chemii w zakresie niezbędnym do zrozumienia teoretycznych podstaw stosowanych technik mikroskopowych w tym mikroskopii elektronowej, konfokalnej, świetlnej i fluorescencyjnej tj. zna zjawisko fluorescencji, fosforescencji, rozproszenia elastycznego i nieelastatycznego elektronów, dyfrakcji, przesunięcia faz, chemicznego utrwalania w powiązaniu z innymi dziedzinami nauki zwlaszcza z fizyką oraz chemiąK_W07

W4. Rozumie zasady doboru poszczególnych metod i technik mikroskopowych stosowanych w naukach biologicznych tj. do badań ultrastruktury TEM, do topografii powierzchnii SEM, do badań przyżyciowych - mikroskopia fluorescencyjna i konfokalna - K_W08

W5. Zna zasady bezpiecznej i ergonomicznej pracy w laboratorium zwłaszca podaczs procedury przygotowywania preparatów podczas utrwalania, trymowania oraz pracy z komórkami prawidlowymi i nowotworowymi z hodowli in vitro - K_W13

UMIEJĘTNOŚCI

U1. Wykonuje poprawnie obserwacje mikroskopowe, interpretuje ich wyniki i formułuje na ich podstawie odpowiednie wnioski- K_U11

U2. Umie stosować zaawansowane techniki mikroskopowe- K_U01

KOMPETENCJE SPOŁECZNE

K1. Jest przekonany o konieczności systematycznej aktualizacji wiedzy biologicznej, zwłaszcza w dynamicznie rozwijających się zaawansowanych technikach mikroskopii fluorescencyjnej - K_K02

K2. Wykazuje aktywną postawę w zdobywaniu, uzupełnianiu i aktualizowaniu wiedzy biologicznej dotyczacej technik mikroskopowych, zwłaszca mikroskopii konfokalnej i fluorescencyjnej, szczególnie pod kątem jej praktycznych zastosowań- K_K03

K3. Jest odpowiedzialny za bezpieczeństwo własne i otoczenia w pracy doświadczalnej z chemikaliam podczas utrwalania materiału w technice mikroskopii elektronoweji, materiałem biologicznym tj. komórkami nowotworowymi i specjalistyczną aparaturą tj. ultramikrotomem - K_K12

Na podstawie uchwały Nr XXIV-27.18/19 Senatu Uniwersytetu Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie z dnia 29 maja 2019 r. dla cyklu kształcenia rozpoczętego w 2019/20

W wyniku zrealizowanych zajęć student:

WIEDZA: absolwent zna i rozumie

W1. Absolwent zna i rozumie w pogłębiony sposób wybrane fakty, zjawiska z zakresu technik mikroskopowych tj. zjawisko fluorescencji, fosforescencji, rozproszenia elastycznego i nieelastatycznego elektronów, dyfrakcji, przesunięcia faz, chemicznego utrwalania w powiązaniu z innymi dziedzinami nauki zwlaszcza z fizyką oraz chemią - K_W01

W2. Absolwent zna i rozumie w pogłębiony sposób specyfikę technik mikroskopowych: mikroskopii elektronowej, fluorescencyjnej i konfokalnej oraz ich główne tendencje rozwojowe tj. nowe metody, FLIM, FRAP,FRET oraz najnowsze osiągnięcia tej nauki, w tym istotne dla człowieka-K_W05

UMIEJĘTNOŚCI

U1. Absolwent potrafi dobierać i stosować właściwe techniki mikroskopowe do określonych celów badawczych oraz modyfikować standardowe procedury do uzyskania określonych celów K_U02

U2. Absolwent potrafi współdziałać z innymi osobami w ramach prac zespołowych (trymowanie, przygotowywanie preparatów) przy wykonywaniu różnych zadań z zakresu technik mikroskopowych tj. mikroskopii fluorescencyjnej, SEM i TEM oraz świetlnej- K_U08

KOMPETENCJE SPOŁECZNE

K1. Absolwent jest gotów do przewodzenia grupie oraz ponoszenia odpowiedzialności za nią i podejmowane decyzje podczas wykonywania części praktycznych z calego cyklu ćwiczeń - K_K02

K2. Absolwent jest gotów do uznawania znaczenia wiedzy z zakresu technik mikroskopowych tj. w badaniach naukowych, medycznych i farmakologicznych (FLIM, TEM, EDX), nauk pokrewnych tj. fizyki i chemii w rozwiązywaniu problemów poznawczych i praktycznych- K_K03